🧪 GB 5009.33 第二法 · 分光光度法

📋 食品中亚硝酸盐的测定 — 盐酸萘乙二胺比色法 | 外标法定量
⚙️ 试剂与设备预处理 ▼
🧪 一、试剂配制(均使用分析纯及蒸馏水)
A 饱和硼砂溶液 (50 g/L) 称取 5.0 g 硼砂,溶于 100 mL 热水中,冷却后摇匀。
B 亚铁氰化钾溶液 (106 g/L) 称取 10.6 g 亚铁氰化钾 [K₄Fe(CN)₆·3H₂O],溶于水并定容至 100 mL,混匀。
C 乙酸锌溶液 (220 g/L) 称取 22.0 g 乙酸锌 [Zn(CH₃COO)₂·2H₂O],溶于水并定容至 100 mL,混匀。
D 对氨基苯磺酸溶液 (4 g/L) 称取 0.4 g 对氨基苯磺酸,溶于 100 mL 水中,避光保存。
E 盐酸萘乙二胺溶液 (2 g/L) 称取 0.2 g 盐酸萘乙二胺,溶于 100 mL 水中,避光保存(临用现配更佳)。
F 亚硝酸钠标准储备液 (200 μg/mL) 准确称取 0.1000 g 亚硝酸钠 (NaNO₂,于硅胶干燥器中干燥 24 h),溶于水并定容至 500 mL。
G 亚硝酸钠标准使用液 (5.0 μg/mL) 临用前,准确吸取 5.0 mL 储备液,置于 200 mL 容量瓶中,加水定容。 必须临用现配
🔬 二、仪器设备准备
分光光度计 开机预热 至少 30 分钟,设定波长 540 nm,检查稳定性;调零用试剂空白。
比色皿 (1 cm) 清洗干净,不得有划痕;用前以蒸馏水润洗,必要时用 1+1 盐酸浸泡后冲洗。
玻璃器皿 所有容量瓶、比色管等需 洗涤洁净,避免硝酸盐/亚硝酸盐污染(不使用含氮洗涤剂)。
分析天平 检查水平并校准,确保称量准确性(精确至 0.0001 g)。
水浴锅 升温至所需温度(70 ℃ 及 100 ℃ 沸水浴),检查恒温性能。
pH 试纸 / 计 (非必须,但可用于检查提取液酸碱度,确保无异常)。
⚠️ 关键提醒:沉淀剂亚铁氰化钾与乙酸锌需按顺序加入(先加亚铁氰化钾,后加乙酸锌),且所有显色试剂需避光操作。
1 样品制备
称取 5 g 均匀试样(平行两份)
置于具塞锥形瓶中
2 热水提取
加入 12.5 mL 饱和硼砂溶液 (50 g/L)
再加入约 150 mL 70 °C 热水
水浴加热 15 min,冷却至室温
3 沉淀蛋白质与脂肪
定量转移至 200 mL 容量瓶
加入 5.0 mL 亚铁氰化钾 (106 g/L) 摇匀
再加入 5.0 mL 乙酸锌 (220 g/L) 摇匀
⚠️ 顺序不可调换,放置 30 min
4 过滤
用定量滤纸过滤
弃去初滤液 30 mL,收集其余滤液备用
5 分取滤液 · 显色准备
分别取滤液及标准系列于 50 mL 比色管中,加水至 40 mL
📈 标准曲线系列
吸取 5.0 μg/mL 亚硝酸钠标准使用液
0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL
置于 50 mL 比色管中,各加蒸馏水至 40 mL
加入 2.0 mL 对氨基苯磺酸 (4 g/L)
摇匀,避光静置 3~5 min
加入 1.0 mL 盐酸萘乙二胺 (2 g/L)
加水至刻度,摇匀
避光静置 15 min
🧪 样品测定
吸取 40 mL 样品滤液
置于 50 mL 比色管中
加入 2.0 mL 对氨基苯磺酸 (4 g/L)
摇匀,避光静置 3~5 min
加入 1.0 mL 盐酸萘乙二胺 (2 g/L)
加水至刻度,摇匀
避光静置 15 min
6 分光光度测定
于 540 nm 波长处测定吸光度
以试剂空白调零,1 cm 比色皿
7 绘制标准曲线 · 计算含量
以标准系列浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线
将样品吸光度代入标准曲线,计算亚硝酸盐含量
✔ 出具结果
按外标法计算样品中亚硝酸盐含量 (mg/kg)
第二法检出限:1 mg/kg  |  定量限:—
📌 关键操作要点:
⚠️ 亚铁氰化钾与乙酸锌的加入顺序不可调换,否则沉淀效果不佳
🌡️ 显色反应需避光操作,静置时间严格控制在 15 min
📊 标准曲线线性相关系数 R² ≥ 0.999
🧪 本流程为 亚硝酸盐 测定;若测 硝酸盐 需增加镉柱还原步骤